在完成小鼠原代腎動脈平滑肌細胞的分離后，需重點關(guān)注細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性和功能維持。首先，將分離的細胞以適當(dāng)密度（建議1×10?/cm2）接種于預(yù)涂膠原蛋白的培養(yǎng)皿中，使用含20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。24小時后更換為含10% FBS的維持培養(yǎng)基，以降低增殖速率，促進收縮表型表達。
關(guān)鍵操作提示：
1. 換液頻率：每48小時換液一次，避免頻繁擾動導(dǎo)致細胞脫落。若觀察到細胞碎片增多，可先用PBS輕柔沖洗后再補液。
2. 傳代控制：細胞融合度達80%時需傳代，使用0.25%胰酶-EDTA消化30秒后立即用含血清培養(yǎng)基終止。原代細胞建議傳代不超過3次，以免表型丟失。
3. 功能驗證：可通過α-SMA免疫熒光染色（陽性率應(yīng)＞90%）及血管緊張素Ⅱ刺激實驗（鈣離子熒光探針檢測）確認(rèn)細胞收縮特性。
常見問題應(yīng)對：
- 細胞貼壁不良：檢查膠原包被時間（需≥2小時）或嘗試添加纖連蛋白（10μg/mL）。
- 自發(fā)分化：若出現(xiàn)長梭形形態(tài)改變，可添加5ng/mL TGF-β1維持表型。
最后，建議凍存早期代次細胞（使用含10% DMSO的凍存液，程序降溫后液氮保存），為后續(xù)實驗保留一致性樣本。通過規(guī)范操作和定期檢測，可確保該模型在高血壓或血管重塑研究中的可靠性。
