優化的核心就是在?平衡靈敏度、特異性和重復性?之間找到黃金點。
一、核心優化參數與調整策略
?封閉條件?
?封閉劑選擇?：?BSA?（尤其適合含脂質或溶血的樣本）或?脫脂奶粉?（成本低，但注意干擾生物素或堿性磷酸酶系統）。?小牛血清?適用于排除相似蛋白干擾，?酪蛋白?或?合成多聚物?可進一步降低背景。
?封閉劑濃度?：對BSA或奶粉進行?梯度測試?（如BSA: 0.5%, 1%, 3%, 5%；脫脂奶粉: 5%, 10%）。
?封閉時間與溫度?：比較?37℃封閉1小時?（加速反應）與?4℃過夜封閉?（提高均勻性，適合低豐度蛋白）。
?洗滌步驟?
?洗滌次數?：從說明書推薦次數開始，?逐步增加次數?（如5次→6次→7次），評估背景降低和信號保留情況。
?洗滌液添加劑?：在PBS或TBS緩沖液中加入?Tween-20?（0.05%-0.1%）或?Triton X-100?（0.01%-0.1%），優化去污能力。
?洗滌體積與方式?：確保每孔洗滌液量?充足（>包被體積）?，采用?浸泡式洗滌?并徹底拍干。
?抗體結合?
?抗體濃度?：對?一抗和二抗?進行?棋盤滴定?，找到信號最強且背景最低的最佳工作濃度。
?孵育時間與溫度?：在說明書推薦范圍內調整（如37℃孵育1-2小時）。若背景高，可嘗試?4℃過夜孵育?以提高特異性。
?樣本處理?
?樣本稀釋液?：使用試劑盒配套的稀釋液或優化自配稀釋液（如含BSA、Tween-20的PBS），以?匹配樣本基質?，減少非特異性結合。
?樣本預處理?：對血清、血漿等樣本進行?高速離心?（≥10,000×g），去除纖維蛋白、細胞碎片等干擾物。
二、優化后驗證的核心指標
判斷參數是否優化成功，需系統性地對比以下指標：
?背景信號?：?陰性對照孔?的OD值應顯著降低。
?信噪比(S/N)?：在低濃度樣本孔中，計算（信號孔OD值 - 陰性對照OD值）/ 陰性對照OD值，?比值應顯著提高?。
?特異性與準確性?：
?加標回收率?：應在?80%-120%? 之間，優化后應更接近100%。
?交叉反應性?：使用GLUT家族其他蛋白等干擾物質測試，信號應無顯著增加。
?精密度（重復性）?：
?板內變異系數(CV)?：同批次內同一樣本復孔間CV應?≤10%?。
?板間/批間CV?：不同批次或操作者間的CV應?≤15%?。
?靈敏度與線性范圍?：
?標準曲線R2值?：應?≥0.99?。
?低濃度樣本回收率?：應在?80%-120%? 之間。
三、關鍵優化原則
?系統性優化?：每次?只改變一個變量?，評估其對信號和背景的影響。
?驗證在實際樣本中?：在含GLUT1的?實際樣本?（如細胞裂解液、組織勻漿）中驗證優化效果，而非僅用標準品。
?建立質控標準?：設定可接受的背景值、回收率（80%-120%）和重復性（CV<10%）標準。
